Сравнительный анализ методик определения эндоглина в диагностике преэклампсии

Цель исследования: оценить уровень эндоглина (sEng) различными тест-системами иммуноферментного анализа (ИФА) у беременных с преэклампсией (ПЭ) и сравнить с контрольной группой.

Дизайн: исследование «случай-контроль».

Материалы и методы. В исследование были включены 72 женщины, которых разделили на две группы. В основную вошли пациентки с ПЭ (n = 38), в контрольную — пациентки с физиологической беременностью (n = 34). В день госпитализации производили забор биологического материала (сыворотки крови и мочи). Аликвоты замораживали и хранили при –70°C. Далее методом ИФА с помощью различных тест-систем определяли уровень sEng в полученных образцах.

Результаты. В сравнении с тремя коммерческими наборами благодаря новому ИФА возможно количественно определить sEng не только в сыворотке крови, но и в моче. Анализ результатов с помощью новой системы показал до двух раз более высокие уровни антигена, чем в коммерческих наборах. Несмотря на различия в оценках содержания антигенов, этот анализ имел диагностическую эффективность, аналогичную широко используемому коммерческому набору для выявления тяжелой ПЭ у беременных на основе содержания sEng в сыворотке, и позволил определить больных пациенток на основе уровней антигенов в моче.

Заключение. Новый ИФА ― быстрый, специфический и точный метод количественной оценки sEng, он является потенциально ценным инструментом для in vitro и клинических исследований пациенток с ПЭ.

Вклад авторов: Васильева М.Ю. — обзор публикаций по теме статьи, сбор клинического материала, статистическая обработка данных, написание текста рукописи; Зазерская И.Е. ― разработка дизайна исследования, проверка критически важного содержания, утверждение рукописи для публикации; Сельков С.А., Соколов Д.И. — разработка дизайна исследования, выполнение лабораторных исследований, проверка критически важного содержания, утверждение рукописи для публикации.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии возможных конфликтов интересов.

Финансирование: работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда [грант № 17-15-01230].

Ключевые слова: иммуноферментный анализ, преэклампсия, растворимый эндоглин

Васильева М.Ю., Зазерская И.Е., Сельков С.А., Соколов Д.И. Сравнительный анализ методик определения эндоглина в диагностике преэклампсии // Женское здоровье и репродукция: сетевое издание. 2021. № 3 (50). URL: https://whfordoctors.su/statyi/sravnitelnyj-analiz-metodik-opredelenija-jendoglina-v-diagnostike-prejeklampsii/ (дата обращения: дд.мм.гггг)

М.Ю. Васильева¹, И.Е. Зазерская¹, С.А. Сельков², Д.И. Соколов²

¹ ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации; Россия, г. Санкт-Петербург

² ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта»; Россия, г. Санкт-Петербург

В течение десятилетий преэклампсия (ПЭ) занимает лидирующую позицию среди осложнений беременности. В соответствии с наиболее признанной на сегодняшний день теорией развития ПЭ, нарушение процессов формирования плаценты в ранние сроки гестации становится причиной АГ. В качестве раннего дефекта, провоцирующего развитие ПЭ, рассматривают нарушение ремоделирования спиральных артерий [15]. Как результат патологической плацентации и нарушения перфузии в плацентарной ткани повышается концентрация факторов, приводящих к эндотелиальной дисфункции и синдрому системного воспалительного ответа [16].

Ишемизированная плацента служит мощным источником антиангиогенных факторов: растворимой формы рецептора к сосудистому фактору роста (sFlt-1) и растворимого эндоглина (soluble endoglin, sEng). Эндоглин представляет собой трансмембранный гомодимерный гликозилированный белок, экспрессируемый на эндотелиальных клетках, мезенхимальных стволовых клетках и клетках трофобластов [1, 4].

На сегодняшний день известно, что при нормальной беременности концентрации растворимых Eng и Flt-1 в плазме крови матери возрастают с увеличением гестационного возраста плода и достигают максимальных значений в конце беременности; в среднем у пациенток с умеренной формой ПЭ повышение концентрации sEng отмечают с 30 недели беременности, а у пациенток с тяжелой формой ― с 23 недели [12].

Значительное усиление продукции sEng в крови матери предшествует появлению симптомов ПЭ и в большей степени коррелирует с тяжестью заболевания, чем уровень sFlt-1 или других растворимых факторов [1], в связи с чем крайне важно разработать новый метод количественного определения sEng в биологических жидкостях. Наличие в практике акушера-гинеколога методики быстрого точного определения уровня sEng может способствовать рутинному поиску беременных с риском развития ПЭ, в том числе тяжелых форм, до появления клинической симптоматики.

Цель исследования: оценить уровень sEng у беременных с ПЭ различными системами иммуноферментного анализа (ИФА) и сравнить с контрольной группой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Коллекция образцов

Образцы сыворотки крови и мочи женщин с ПЭ и женщин с физиологической беременностью были собраны в Перинатальном центре Национального медицинского исследовательского центра им. В.А. Алмазова (Россия, г. Санкт-Петербург). Диагноз ПЭ основывался на критериях клинических рекомендаций Министерства здравоохранения России [1].

Основную группу (n = 38) составили беременные с ПЭ, которую разделили на две подгруппы в соответствии с критериями диагностики ПЭ: пациентки с умеренной ПЭ (n = 18) и с тяжелой ПЭ (n = 20). В первую подгруппу определили женщин с диагностированным повышением систолического АД ≥ 140 мм рт. ст. и/или повышением диастолического АД ≥ 90 мм рт. ст. после 20 недель гестации, впервые выявленным или ранее проявлявшемся на фоне хронической АГ в сочетании с протеинурией.

Пациентки с систолическим АД ≥ 160 мм рт. ст. и/или диастолическим АД ≥ 110 мм рт. ст. впервые после 20 недель беременности или на фоне хронической АГ в сочетании с протеинурией или хотя бы с одним другим параметром, свидетельствовавшим о присоединении полиорганной недостаточности, были отнесены к беременным с тяжелой ПЭ. Контрольную группу составили пациентки с физиологической беременностью (n = 34).

В исследуемые группы не вошли пациентки, перенесшие онкологические заболевания, трансплантацию органов, получающие антиретровирусную терапию или страдающие наркозависимостью.

Образцы биологической жидкости были взяты в день госпитализации, в течение 24 часов с момента поступления в стационар. У пациенток с тяжелой ПЭ забор материала осуществляли сразу же при поступлении в отделение анестезиологии и реанимации; у беременных с умеренной ПЭ материал брали утром на следующий день после поступления в отделение патологии беременности.

Кровь собирали в пробирки с ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислотой). Мочу собирали в одноразовые контейнеры и без последующей пробоподготовки аликвотировали. Все образцы были собраны у пациенток после получения информированного согласия. Образцы замораживали и хранили при –70°C. После пробоподготовки методом ИФА с помощью новой системы, разработанной в лаборатории гибридомных технологий Российского научного центра радиологии и хирургических технологий имени академика А.М. Гранова, и с помощью коммерческих систем было выполнено количественное определение уровня sEng.

Моноклональные антитела

Панель моноклональных антител (MAb) к человеческому sEng была произведена в лаборатории гибридомных технологий Российского научного центра радиологии и хирургических технологий имени академика А.М. Гранова. Продукция и иммунохимические свойства реагентов описаны в предыдущих публикациях [4, 5]. Два собственных метода ИФА были разработаны на основе MAb 4E4, 4C9 и SN6h.

Захватывающие MAb разбавляли в PBS (Phosphate buffered saline, натрий-фосфатном буфере) (10 мг/мл) и адсорбировали на твердой фазе (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) при –37°C в течение 1,5–2 часов. Образцы инкубировали в чашках при –37°С в течение часа. Связанные молекулы антигена выявляли с помощью MAb, конъюгированных с HRP (Horseradish peroxidase, пероксидазой хрена), инкубированных при –37°C в течение 45 минут. Мечение ферментов проводили по стандартной методике [6].

Рекомбинантный эндоглин (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США) использовали в качестве калибратора для внутренних систем. Белок восстанавливали в PBS с добавлением BSA (Bovine Serum Albumin, бычий сывороточный альбумин) (2 мг/мл). Аликвоты хранили при –70°С. Рабочие растворы калибратора готовили с помощью коммерческого стабилизатора (Xema, Москва, РФ). Образцы, калибратор и MAb, конъюгированные с пероксидазой, разбавляли трис-буферным солевым раствором (TBS, pH 7,4) с добавлением 0,5% твин-20. Все образцы были протестированы как минимум в двух повторениях; при анализе использовали средние значения. Оценку эффективности ИФА проводили в соответствии со стандартными процедурами [7, 8].

Иммунопреципитация

Эксперименты по иммунопреципитации проводили способом, описанным в книге под редакцией D. Catty [6]. Образцы разбавляли в три раза TBS и наносили на иммуноаффинную колонку, содержащую иммобилизованные моноклональные антитела ― MAb 4E4 к эндоглину. Связывание антител с CNBr-активированной сефарозой (GE Healthcare) проводили в соответствии с инструкциями производителя. Связанный антиген элюировали цитрат-фосфатным буфером (pH 3,6). Элюаты немедленно доводили до нейтрального pH, используя 1 M трис-HCl (pH 9,0). Антиген-содержащие растворы концентрировали центрифугированием через мембраны Vivaspin с отсечкой 30 кДа (Sartorius).

Рекомбинантные белки

Три рекомбинантных фрагмента sEng (Eng26-359, Eng26-406 и Eng26-586) экспрессировались в клетках HEK293. Соответствующие фрагменты гена клонировали в вектор pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Клетки трансфицировали кальциево-фосфатным методом преципитации [14].

SDS—PAGE, Blue Native PAGE и вестерн-блоттинг

Иммунопреципитированные и рекомбинантные препараты sEng анализировали с помощью электрофореза белков в полиакриламидном геле, имевшем концентрацию 7,5% (SDS-PAGE, sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis) в восстанавливающих (2%, 2-меркаптоэтанол) и невосстанавливающих условиях. Электроперенос образцов на нитроцеллюлозные мембраны производили полусухим методом. Фильтры блокировали раствором казеина 2,5 мг/мл в TBS в течение 30 минут при комнатной температуре, постоянно перемешивая. Первичные sEng-MAbs 2E1 (5 мг/мл), 4B7 (10 мг/мл) или SN6h (10 мг/мл) добавляли к мембранам и инкубировали накануне вечером при 4°C.

Промытые мембраны инкубировали с поликлональными козьими антителами против Ig мыши, меченными HRP, в течение часа при комнатной температуре. Все антитела получали с помощью блокирующего буфера. Мембраны были разработаны с использованием тетраметилбензидина, TMB (Sigma, Сент-Луис, Миссури). Молекулярные массы антигенов оценивали на основе предварительно окрашенной белковой лестницы PageRuler (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Денситометрический анализ мембран вестерн-блоттинга проводили с использованием программы ImageJ [9]. Blue Native PAGE изолированных молекул sEng выполняли по методу, описанному в работе I. Wittig и соавт. [10].

Статистический анализ и визуализация данных

Статистический анализ и визуализацию данных выполняли с использованием языка программирования R (версия 3.4.4) и графических пакетов ggplot2 и cowplot. T-критерий использовали для анализа основных данных, а точный критерий Фишера ― для анализа таблиц непредвиденных обстоятельств. Регрессионный анализ проводили с использованием обычной регрессии наименьших квадратов или регрессии Деминга. Параметры модели были представлены как оценки ± стандартные ошибки. Величину эффекта оценивали как d по Коэну. Статистический анализ кривых ROC проводили с помощью пакета pROC [11]. Оценка 95%-ого ДИ площади под кривой (AUC) и статистические сравнения AUC двух тестов были выполнены с использованием методов начальной загрузки (n ≥ 10000).

РЕЗУЛЬТАТЫ

С целью проведения сравнительного исследования сэндвич-панели ИФА для количественной оценки sEng мы собрали образцы сыворотки крови и мочи женщин с ПЭ и женщин с физиологической беременностью. Концентрации sEng оценивали с использованием ИФА 4E4–4C9, разработанного в лаборатории, и трех имеющихся в продаже наборов для ИФА. Новый ИФА был разработан на основе хорошо охарактеризованного антиэндоглинового MAb SN6h и реагента, конъюгированного с пероксидазой 4E4. Однако систему SN6h-4C9 не использовали, так как она показала очень плохое обнаружение рекомбинантного антигена (скорее всего, из-за взаимной конкуренции MAb).

Обобщенные данные эксперимента приведены в таблице 1. Высокие и почти идентичные концентрации sEng были измерены в сыворотке крови человека с помощью систем 4E4–4C9 и SN6h–4E4, тогда как гораздо более низкие уровни были получены при использовании коммерческих наборов. Кроме того, коммерческие анализы не смогли обнаружить sEng в моче.

Таблица 1

Концентрация эндоглина (нг/мл) в различных биологических жидкостях (n = 3), установленная с помощью двух сэндвич-методов иммуноферментного анализа лаборатории гибридомных технологий и с помощью трех коммерческих наборов.

Примечание: а ― среднее значение (диапазон)

Анализ 4E4–4C9 продемонстрировал превосходные характеристики по сравнению с протестированными коммерческими анализами. Общее время анализа (от загрузки образцов до считывания) составляло менее 2-х часов, в то время как для исследуемых коммерческих анализов требовалось более 4-х часов.

На сегодняшний день широко обсуждается, что увеличение содержания sEng в сыворотке крови у беременных связано с развитием ПЭ [12]. Поэтому мы провели сравнительное исследование диагностической эффективности метода ИФА 4E4–4C9 и широко используемого набора R&D Systems для выявления заболеваний. Были собраны наборы образцов сыворотки крови и мочи у женщин с умеренной и тяжелой ПЭ. Клинические характеристики пациенток и количество протестированных образцов представлены в таблице 2.

Таблица 2. Клиническая характеристика пациенток с физиологической беременностью и пациенток с преэклампсией (ПЭ), принявших участие в данном исследовании.

Примечания.

1. Данные представлены как среднее значение ± 95%-ный ДИ для непрерывных переменных (^а) и как «% (n)» для номинальных переменных (^b).

2. P-критерии были рассчитаны для следующих трех сравнений: ¹ ― контроль против умеренной ПЭ; ² ― контроль по сравнению с тяжелой ПЭ; ³ ― умеренная ПЭ в сравнении с тяжелой ПЭ. Для расчета значений p использовали t-критерий Велча (^c) и точный критерий Фишера (^d).

Были обнаружены лишь незначительные различия в диагностической эффективности метода ИФА 4E4–4C9 и коммерческого набора. Оба анализа выявили повышенные уровни sEng в сыворотке крови только у женщин с тяжелой ПЭ, в то время как у женщин с умеренной ПЭ и у пациенток контрольной группы концентрации антигена были схожи (рис. A). Анализ кривых ROC показал, что уровни sEng в сыворотке, измеренные любой системой, были умеренно прогностическими для ПЭ. Однако оба теста позволили выделить группу пациенток с тяжелым заболеванием (рис. B). AUC для теста 4E4–4C9 была немного больше, чем для набора R&D Systems (p = 0,020). Интересно, что ИФА 4E4–4C9 обнаружил повышенную экскрецию sEng с мочой у пациенток при тяжелой ПЭ (рис. A). Прогностическая сила уровней sEng в моче была оценена ниже, чем у антигена в сыворотке крови (рис. B), но результаты существенно не различались (p = 0,197).

Было хорошее совпадение (коэффициент Пирсона ― 0,938) между логарифмически преобразованными оценками содержания sEng в сыворотке, полученными с помощью ИФА 4E4–4C9 и коммерческого набора (рис. C). Однако график различий показал, что по сравнению с измерениями коммерческого набора внутренняя система имела тенденцию к завышению уровней антигена в образцах с низкими концентрациями и к занижению их в образцах с высокими концентрациями (рис.D). Поскольку эта тенденция была почти линейной, она не повлияла на прогностическую способность ИФА 4E4–4C9 для диагностики ПЭ по сравнению с коммерческим набором.

Рисунок. Уровни sEng в сыворотке и моче у женщин с физиологической беременностью или беременностью, осложненной преэклампсией (ПЭ).

Примечание. Уровни оценивали с помощью ИФА 4E4-4C9 и набора R&D Systems. A ― индивидуальные уровни (средние значения ± стандартное отклонение). B ― кривые ROC для прогноза тяжелой ПЭ. Серые области соответствуют 95%-ому ДИ. C ― регрессия Деминга между логарифмически преобразованными оценками в двух анализах (a = -2,528 ± 0,155, b = 1,281 ± 0,053, SD (остатки) = 0,130). D ― график процентной разницы 

ОБСУЖДЕНИЕ

По данным Федеральной службы государственной статистики РФ, более 15 лет среди заболеваний, осложняющих роды, вторую позицию занимают гипертензивные расстройства, протеинурия и отеки. ПЭ повсеместно встречается в практике акушеров-гинекологов в течение многих десятилетий. Несмотря на имеющиеся достижения, по-прежнему результативным патогенетическим лечением ПЭ остается родоразрешение. Симптоматическая терапия с целью пролонгирования беременности при тяжелых формах ПЭ на ранних сроках создает риски для матери и плода. Поэтому внимание ученых обращено к ранней диагностике и прогнозированию течения ПЭ.

Так в 2017 году было опубликовано исследование, в ходе которого 564 беременные были скринированы на сроке гестации 9–10 недель, была определена концентрация матриксной металлопротеиназы-12 в сыворотке крови при беременности, осложненной и не осложненной ПЭ, и установлена статистически значимая разница между концентрациями фактора в сыворотке крови групп беременных, что свидетельствовало о высокой роли ММП-12 на начальных этапах плацентации и в ассоциации с риском развития ПЭ [20].

За последние 5 лет зарубежные научные сообщества, такие как NICE (National Institute For Health And Care Excellence), FIGO (The International Federation of Gynecology and Obstetrics), предложили руководства по диагностике и скринингу ПЭ, включающие оценку соотношения ангиогенных факторов sFlT/PlGF. Такой метод исследования считается надежным, но пока остается малодоступным. Данные показатели не являются универсальными, возможны и другие пороговые значения соотношения sFlt/PlGF, разработанные лабораториями или предоставленные компаниями-разработчиками [2] [19].

Измерения концентрации sEng в биологических жидкостях проводили в исследованиях по прогнозу течения атеросклеротических процессов [18], мониторингу роста и метастатической активности опухолей у онкологических больных [2], оценке вероятности развития ПЭ у беременных женщин [3]. sEng является рецептором III типа комплексов, которые связывают молекулы TGF-b, BMP и активина A [4].

ММР-14 ― единственный известный фермент, ответственный за протеолитическое расщепление антигена [4]. К функциям sEng относят регуляцию сосудистого тонуса путем взаимодействия с эндотелиальной синтазой оксида азота, ингибирование формирования эндотелиальной капиллярной трубки и усиление проницаемости сосудов [17]. Фрагменты экстраклеточной части молекулы sEng обнаруживают в сыворотке крови, моче и спинномозговой жидкости.Количественное определение sEng в биологических жидкостях представляется сложной задачей. В более ранних публикациях было показано, что набор ИФА, основанный на различных парах MAb к sEng, выявляет различные количества антигена в сыворотке крови человека. Различия между самой высокой и самой низкой оценками содержания sEng в одних и тех же образцах достигли двух порядков [4].

В этом исследовании мы количественно определяли sEng в сыворотке крови и моче, используя набор ИФА, основанный на захвате MAb 4E4 и конъюгированных с пероксидазой MAb 4C9 (4E4–4C9). Образцы были также протестированы с помощью трех коммерческих наборов ИФА для количественного определения sEng и с помощью анализа, основанного на хорошо охарактеризованном MAb SN6h (SN6h–4E4).

Системы 4E4–4C9 и SN6h–4E4 выявляли более высокие концентрации sEng во всех типах образцов, в то время как коммерческие анализы не смогли обнаружить антиген в моче. Опубликовано исследование, в котором уровни антигенов в моче у женщин с ПЭ повышались уже на 12-й неделе беременности [14]. Эти данные позволяют предположить, что быстрый неинвазивный тест для раннего скрининга ПЭ может быть разработан на основе новой ИФА.

Таким образом, оценка уровня sEng в биологических жидкостях может иметь прогностическую ценность для диагностики ПЭ на ранних сроках, а также может помочь в прогнозировании течения болезни и успешности терапии. Поэтому поиск оптимальной методики определения концентрации sEng в сыворотке крови и моче столь важен практикующему врачу для доклинической диагностики заболевания и оценки эффективности лечения ПЭ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ методик, представленный в данной работе, показывает специфичность, чувствительность и точность новой тест-системы ИФА для количественного определения sEng в сыворотке крови и моче. Продемонстрирована высокая прогностическая сила нового метода ИФА при тяжелой ПЭ на основе уровней sEng в сыворотке крови и моче.

[1] Клинические рекомендации. «Преэклампсия. Эклампсия. Отеки, протеинурия и гипертензивные расстройства во время беременности, в родах и послеродовом периоде»; 2021. 81 с. URL: https://rd1.medgis.ru/uploads/userfiles/shared/StandartMed/Protokol-acusher/preeklampsia-eklampsia-2021.pdf (дата обращения ― 15.08.2021).

[2] National Institute for Health and Care Excellence. NICE guidance. PlGF-based testing to help diagnose suspected preeclampsia (Triage PlGF test, Elecsys immunoassay sFlt-1/ PlGF ratio, DELFIA Xpress PlGF 1-2-3 test, and BRAHMS sFlt-1 Kryptor/BRAHMS PlGF plus Kryptor PE ratio). Diagnostics guidance; 2016. URL: https://www.nice.org.uk/guidance/dg23/resources/plgfbased-testing-to-help-diagnose-suspected-preeclampsia-triage-plgf-test-elecsys-immunoassay-sflt1plgf-ratio-delfia-xpress-plgf-123-test-and-brahms-sflt1-kryptorbrahms-plgf-plus-kryptor-pe-ratio-pdf-1053688576453 (дата обращения ― 15.08.2021).

[3] Клинические рекомендации. «Преэклампсия. Эклампсия. Отеки, протеинурия и гипертензивные расстройства во время беременности, в родах и послеродовом периоде»; 2021. 81 с. URL: https://rd1.medgis.ru/uploads/userfiles/shared/StandartMed/Protokol-acusher/preeklampsia-eklampsia-2021.pdf (дата обращения ― 15.08.2021).

1. Armaly Z., Jadaon J.E., Jabbour A. et al. Preeclampsia: Novel Mechanisms and Potential Therapeutic Approaches. Front. Physiol. 2018; 9: 973. DOI: 10.3389/fphys.2018.00973
2. Paauwe M., Heijkants R.C., Oudt C.H. et al. Endoglin targeting inhibits tumor angiogenesis and metastatic spread in breast cancer. Oncogene. 2016; 35(31): 4069– DOI: 10.1038/onc.2015.509
3. Karampoor S., Zahednasab H., Ramagopalan S. et al. Angiogenic factors are associated with multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 2016; 301: 88–93. DOI: 10.1016/j.jneuroim.2016.11.005
4. Smirnov I.V., Gryazeva I.V., Samoylovich M.P. et al. Different Pairs of Monoclonal Antibodies Detect Variable Amounts of Soluble Endoglin in Human Blood Plasma. Immunochem. Immunopathol. 2016; 2(2): 121. DOI: 10.4172/2469-9756.1000121
5. Смирнов И.В., Грязева И.В., Самойлович М.П. и др. Панель моноклональных антител против эндоглина человека: получение и характеристика. Цитология. 2015; 57(7): 499–508. [Smirnov I.V., Griazeva I.V., Samoilovich M.P. et al. Production and characterization of monoclonal antibodies against human endoglin. 2015; 57(7): 499–508. (in Russian)]
6. Catty D., ed. Antibodies: a practical approach. Vol. I. Oxford: IRL Press; 1988. 259 p.
7. Armbruster D.A., Pry T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Biochem. Rev. 2008; 29 Suppl 1(Suppl 1): S49–52.
8. Wild D. ed. The immunoassay handbook. Theory and application of ligand binding, ELISA and related techniques. 4th ed. Amsterdam: Elsevier Science; 2013.
9. Schneider C.A., Rasband W.S., Eliceiri K.W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Methods. 2012; 9(7): 671–5. DOI: 10.1038/nmeth.2089
10. Wittig I., Braun H.-P., Schägger H. Blue native PAGE. Nat. Protoc. 2006; 1(1): 418–28. DOI: 10.1038/nprot.2006.62
11. Gysi D.M., Voigt A., Fragoso T.M. et al. wTO: an R package for computing weighted topological overlap and a consensus network with integrated visualization tool. BMC Bioinformatics. 2018; 19(1): 392. DOI: 10.1186/s12859-018-2351-7
12. Romero R., Nien J.K., Espinoza J. et al. A longitudinal study of angiogenic (placental growth factor) and anti-angiogenic (soluble endoglin and soluble vascular endothelial growth factor receptor-1) factors in normal pregnancy and patients destined to develop preeclampsia and deliver a small for gestational age neonate. Matern. Fetal. Neonatal. Med. 2008; 21(1): 9–23. DOI: 10.1080/14767050701830480
13. Liang Y.-C., Chang L., Qiu W. et al. Ultrasensitive Magnetic Nanoparticle Detector for Biosensor Applications. Sensors (Basel). 2017; 17(6): 1296. DOI: 10.3390/s17061296
14. Martinez-Fierro M.L., Castruita-De La Rosa C., Garza-Veloz I. et al. Early pregnancy protein multiplex screening reflects circulating and urinary divergences associated with the development of preeclampsia. Pregnancy. 2018; 37(1): 37–50. DOI: 10.1080/10641955.2017.1411946
15. Martinez-Fierro M.L., Hernández-Delgadillo G.P., Flores-Morales V. et al. Current model systems for the study of preeclampsia. Exp. Biol. Med. (Maywood). 2018; 243(6): 576– DOI: 10.1177/1535370218755690
16. Hofmeyr G.J., Lawrie T.A., Atallah Á.N. et al. Calcium supplementation during pregnancy for preventing hypertensive disorders and related problems. Cochrane Database Syst. Rev. 2018; 10(10): CD001059. DOI: 10.1002/14651858.CD001059.pub5
17. Lopes Perdigao J., Chinthala S., Mueller A. et al. Angiogenic Factor Estimation as a Warning Sign of Preeclampsia-Related Peripartum Morbidity Among Hospitalized Patients. Hypertension. 2019; 73(4): 868– DOI: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.118.12205
18. Ma Q.-Q., Yang X.-J., Yang N.-Q. et al. Study on the levels of uric acid and high-sensitivity C-reactive protein in ACS patients and their relationships with the extent of the coronary artery lesion. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2016; 20(20): 4294–8
19. Poon L.C., Shennan A., Hyett J.A. et al. The International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO) initiative on pre-eclampsia: A pragmatic guide for first-trimester screening and prevention. J. Gynaecol. Obstet. 145 Suppl 1(Suppl 1): 1–33. DOI: 10.1002/ijgo.12802
20. Яковлева Н.Ю., Васильева Е.Ю. Концентрация матриксной металлопротеиназы-12 в I триместре у беременных с преэклампсией. Акушерство и Гинекология Санкт-Петербурга. 2017; (4): 12–5. [Yakovleva N.Yu., Vasileva E.Yu. The concentration of matrix metalloproteinase-12 in the I trimester in pregnant woman with pre-eclampsia. Obstet. Gynaecol. Saint-Petersburg. 2017; (4): 12–5. (in Russian)]