Фрагментация ДНК сперматозоидов как одна из причин привычного невынашивания беременности

Цель обзора: рассмотреть роль мужского фактора, а именно фрагментации ДНК сперматозоидов, в привычном невынашивании беременности.

Основные положения. В статье приведены данные о значении фрагментации ДНК сперматозоидов в патогенезе привычного невынашивания беременности. Описаны основные причины, методы детекции и подходы к снижению фрагментации ДНК сперматозоидов. Представлены сведения о влиянии фрагментации ДНК сперматозоидов не только на невынашивание беременности, но и на оплодотворение и последующее раннее эмбриональное развитие.

Заключение. Определение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте может являться прогностически значимым при выборе оптимальной стратегии преодоления бесплодия с помощью ВРТ. Кроме того, своевременная диагностика и последующая коррекция высокого уровня фрагментации ДНК сперматозоидов позволит снизить частоту репродуктивных потерь, что особенно актуально для пар с привычным невынашиванием беременности в анамнезе.

Ключевые слова: вспомогательные репродуктивные технологии, мужское бесплодие, привычное невынашивание беременности, сперматозоиды человека, фрагментация ДНК

Ищук М.А.,  Комарова Е.М. Фрагментация ДНК сперматозоидов как одна из причин привычного невынашивания беременности 2021. № 4 (51). URL: https://whfordoctors.su/statyi/fragmentacija-dnk-spermatozoidov-kak-odna-iz-prichin-privychnogo-nevynashivanija-beremennosti/ (дата обращения: дд.мм.гггг)

Sperm DNA fragmentation and subsequent recurrent pregnancy loss

M.A. Ishchuk, E.M. Komarova

D.O. Ott Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology

Objective of the Review: To provide an overview of contribution of male factor infertility, particularly sperm DNA fragmentation, in the pathogenesis of recurrent pregnancy loss.

Key Points. The article provides data about significance of sperm DNA fragmentation in the pathogenesis of recurrent pregnancy loss. The main causes, detection methods and approaches to reducing sperm DNA fragmentation are described. We present the studies not only on the effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage, but also on fertilization and subsequent early embryo development.

Conclusion. The sperm DNA fragmentation determining is important in infertility treatment when ART are used. In addition, early diagnosis and subsequent correction of a high level of sperm DNA fragmentation will reduce the frequency of reproductive losses, which is especially important for couples with recurrent of pregnancy loss.

Keywords: human sperm, sperm DNA fragmentation, recurrent pregnancy loss, male infertility, assisted reproductive technologies.

М.А. Ищук, Е.М. Комарова
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта»; Россия, г. Санкт-Петербург

Согласно определению ВОЗ, под привычным невынашиванием понимают наличие в анамнезе подряд трех и более самопроизвольных прерываний беременности на сроке до 22 недель. По данным литературы, привычное невынашивание наблюдается у 2–5% пар репродуктивного возраста [1].

Причинами невынашивания беременности являются анатомическая дисфункция, эндокринные расстройства, инфекционные агенты, иммунологический и генетический факторы. Современные подходы к лечению позволяют в большинстве случаев преодолевать привычное невынашивание, однако патогенез более половины случаев остается невыясненным. К возможным причинам относят дефицит лютеиновой фазы, хронический эндометрит, наследственную тромбофилию [1].

Основное внимание исследователи этой проблемы уделяют влиянию женского фактора, однако новые данные позволяют предположить, что 40–50% случаев привычного невынашивания могут быть обусловлены мужским фактором [2]. Около 7% мужчин репродуктивного возраста сталкиваются с проблемой бесплодия [3]. Чаще всего это связано с объемом эякулята, качественными и количественными характеристиками сперматозоидов, оценку которых принято проводить согласно руководству ВОЗ.

Показано, что ухудшение качественных характеристик сперматозоидов, таких как подвижность (астенозооспермия) и морфология (тератозооспермия), ассоциировано с мужским бесплодием [4]. Вместе с тем существует небольшое количество противоречивых работ по оценке связи между параметрами спермограммы и привычным невынашиванием беременности [5, 6]. К настоящему моменту статистически значимая связь установлена только между привычным невынашиванием беременности и аномальным мужским кариотипом, в то время как качественные характеристики сперматозоидов, потенциально влияющие на эмбриональное развитие, в частности морфология и фрагментация их ДНК, до сих пор остаются предметом изучения.

Современные исследования показали, что фрагментация ДНК сперматозоидов может влиять на оплодотворение, последующее развитие эмбриона, имплантацию и беременность [7]. Под фрагментацией ДНК сперматозоидов понимают наличие одно- и двунитевых разрывов в молекуле ДНК. Этиология фрагментации ДНК сперматозоидов многофакторна, среди основных причин можно выделить ошибки в ходе реорганизации хроматина в спермиогенезе, воздействие свободных радикалов, в частности активных форм кислорода, образующихся в результате окислительного стресса, а также апоптоз. Стоит отметить, что часть разрывов в ДНК сперматозоида может быть репарирована ферментами ооцита после оплодотворения, тогда остановка в эмбриональном развитии происходит, когда степень повреждения ДНК превышает репаративные способности ооцита [8].

Для детекции повреждения ДНК сперматозоидов разработан ряд анализов, среди них методы, позволяющие детектировать разрывы напрямую, например флуоресцентное мечение одно- и двунитевых разрывов ДНК (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end labelling assay), ник-трансляция (in situ nick translation assay), электрофорез единичных клеток (single cell gel electrophoresis assay, т. н. Comet Assay). Существуют и непрямые методы, при которых повреждения в ДНК регистрируют после предварительной обработки: окрашивание акридиновым оранжевым (sperm chromatin structure assay), тест на дисперсию хроматина (sperm chromatin dispersion, т. н. Halo-test).

К методам, при которых опосредованно, через анализ соотношения гистонов к протаминам в сперматозоиде, оценивается качество компактизации его ДНК, относится окрашивание толуидиновым синим и хромомицином А3. Данные методы также отличаются по типу регистрируемых разрывов, сложности исполнения, цене.

Многие факторы, такие как различные методы детекции повреждения ДНК сперматозоидов, отсутствие стандартизированных методик и разнообразие критериев включения пациентов, приводят к тому, что результатам разных работ сложно сопоставить. Не существует общепринятого референсного значения по доле сперматозоидов с фрагментированной ДНК, которое позволило бы оценить влияние на развитие эмбрионов. Эта цифра довольно сильно варьирует в разных лабораториях: 10% [9], 15% [10], 25% [11], 30% [12], 35% [13]. Интересно, что, согласно новому шестому руководству ВОЗ по исследованию и оценке эякулята человека, тест на фрагментацию ДНК сперматозоидов включен в расширенную спермограмму, при этом референсные значения по доле сперматозоидов с фрагментированной ДНК рекомендовано устанавливать в каждой конкретной лаборатории самостоятельно.

Вопрос о влиянии фрагментации ДНК сперматозоидов на эффективность оплодотворения и качество эмбрионов при использовании ВРТ до сих пор остается открытым. Согласно данным, представленным в недавних обзорах и метаанализах, фрагментация ДНК сперматозоидов ассоциирована с неудачами при внутриматочных инсеминациях, а также с частотой наступления беременности после ЭКО и, в меньшей степени, после ИКСИ [14–16]. Кроме того, фрагментация ДНК сперматозоидов негативно коррелирует с развитием эмбрионов, имплантацией и позитивно с прерыванием беременности.

В метаанализе, представленном J.A. Collins и соавт. [17], показана ассоциация между фрагментацией ДНК сперматозоидов и результатами циклов ЭКО/ИКСИ, что подтверждается и в других работах [18–20]. Многие исследователи пришли к выводу, что анализ фрагментации ДНК сперматозоидов должен стать частью рутинной диагностики мужского бесплодия [7, 21].

Опубликован ряд работ, в которых обнаружено, что фрагментация ДНК сперматозоидов может являться причиной невынашивания беременности. Так, в метаанализе J. Tan и соавт. продемонстрирована взаимосвязь между высоким уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов и привычным невынашиванием [22]. В проспективном когортном исследовании выявлено, что у мужчин доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК была существенно выше в группе с потерей беременности, чем в контрольной группе мужчин из фертильных пар, вне зависимости от таких параметров спермограммы, как морфология и подвижность, что указывает на связь между фрагментацией ДНК сперматозоидов и потерей беременности даже при нормальных показателях спермограммы [23].

T. Carlini и соавт. также показали, что повышение фрагментации ДНК сперматозоидов ассоциировано с увеличением числа самопроизвольных абортов. Авторы предполагают, что чем выше уровень фрагментации ДНК, тем больше вероятность нарушения эмбрионального развития [24].

Кроме того, в недавнем исследовании продемонстрировано, что в парах, у которых регистрировалось прерывание беременности, у мужчин отмечалось повышение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК [5].

Таким образом, оценка фрагментации ДНК сперматозоидов в эякуляте мужчин может служить диагностическим инструментом у пар с привычным невынашиванием беременности.

Исследования фрагментации ДНК сперматозоидов ведутся в нескольких направлениях. Изучается не только возможная связь с повторяющимися потерями беременности [5, 24, 25], возрастает интерес и к типам повреждений, присутствующих в ДНК [19, 26], к стратегиям снижения фрагментации ДНК в сперматозоидах, например при криоконсервации [27, 28]. Несмотря на проведение в последние два десятилетия сотни исследований в области фрагментации ДНК сперматозоидов, для понимания этой проблемы предстоит пройти долгий путь. Значительное количество обзоров и метаанализов призывают к дальнейшим исследованиям с более скрупулезным отбором групп, а также к использованию стандартизированных методов анализа [29, 30].

В настоящее время у специалистов нет единой позиции относительно тактики коррекции высокого уровня фрагментации ДНК сперматозоидов. Однако существует ряд исследований, посвященных возможностям различных терапевтических подходов к снижению доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте пациентов. Так, например, в нескольких работах показано, что более короткое время воздержания позволяет снизить уровень фрагментации ДНК [31, 32]. В случаях, когда показана хирургическая коррекция варикоцеле, после операции отмечается уменьшение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК [33, 34].

Сейчас апробированы новые методы отбора сперматозоидов, в частности сортировка клеток с помощью специальных магнитных сортеров (magnetic-activated cell sorting) [35, 36]. При применении дополнительных методов отбора сперматозоидов, таких как отбор при большем увеличении (ИМСИ) [37, 38], физиологический отбор сперматозоидов на основе связывания с гиалуроновой кислотой (ПИКСИ) [39, 40], отмывка сперматозоидов в градиенте силиконовых частиц, метод swim-up [41–43], получены противоречивые результаты.

Использование для оплодотворения тестикулярных сперматозоидов у мужчин с олигозооспермией и высокими показателями фрагментации ДНК оказалось весьма эффективным [21, 44].

Исследование Е. Greco и соавт. внесло вклад в понимание этиологии возникновения повреждений ДНК сперматозоидов, вероятно, часть разрывов может образовываться уже после того, как сперматозоиды покидают яичко [45]. Позднее некоторые авторы продемонстрировали аналогичные результаты [21, 46]. Большое количество исследований посвящено антиоксидантной терапии. В некоторых из них выявлен положительный эффект от применения антиоксидантов для коррекции высокого уровня сперматозоидов с фрагментированной ДНК [47, 48]. Однако общий эффект антиоксидантной терапии до сих пор остается спорным, в основном из-за нестандартизованных методик характеристики активных форм кислорода или антиоксидантной способности, разнообразия методов определения фрагментации ДНК, сложностей в оценке эффективности оплодотворения, развития эмбрионов и наступления беременности [49].

Заключение

Определение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте может являться прогностически значимым при выборе оптимальной стратегии преодоления бесплодия с помощью ВРТ. Кроме того, своевременная диагностика и последующая коррекция высокого уровня фрагментации ДНК сперматозоидов позволит снизить частоту репродуктивных потерь, что особенно актуально для пар с привычным невынашиванием беременности в анамнезе.

1. Practice Committee of the ASRM. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Steril. 2012; 98(5): 1103–1111. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2012.06.048
2. Kumar N., Singh A. Trends of male factor infertility, an important cause of infertility: a review of literature. Hum. Reprod. Sci. 2015; 8(4): 191–6. DOI: 10.4103/0974-1208.170370
3. Lotti F., Maggi M. Ultrasound of the male genital tract in relation to male reproductive health. Reprod. Update. 2015; 21(1): 56–83. DOI: 10.1093/humupd/dmu042
4. Le M.T., Nguyen T.A.T., Nguyen H.T.T. et al. Does sperm DNA fragmentation correlate with semen parameters? Med. Biol. 2019; 18(4): 390–6. DOI: 10.1002/rmb2.12297
5. Eisenberg M.L., Sapra K.J., Kim S.D. Semen quality and pregnancy loss in a contemporary cohort of couples recruited before conception: data from the Longitudinal Investigation of Fertility and the Environment (LIFE) Study. 2017; Steril. 108(4): 613–19. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2017.07.008
6. Li J., Luo L., Diao J. et al. Male sperm quality and risk of recurrent spontaneous abortion in Chinese couples: a systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2021; 100(10): e24828. DOI: 10.1097/MD.0000000000024828
7. Agarwal A., Majzoub A., Baskaran S. et al. Male reproductive health and infertility sperm DNA fragmentation: a new guideline for clinicians. World J. Mens Health. 2020; 38(4): 412–71. DOI: 10.5534/wjmh.200128
8. Evenson D.P., Jost L.K., Marshall D. et al. Utility of the sperm chromatin structure assay as a diagnostic and prognostic tool in the human fertility clinic. Reprod. 1999; 14(4): 1039–49. DOI: 10.1093/humrep/14.4.1039
9. Ozmen B., Caglar G.S., Koster F. et al. Relationship between sperm DNA damage, induced acrosome reaction and viability in ICSI patients. Biomed. Online. 2007; 15(2): 208–14. DOI: 10.1016/s1472-6483(10)60710-9
10. Benchaib M., Lornage J., Mazoyer C. et al. Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation as a prognostic indicator of assisted reproductive technology outcome. Steril. 2007; 87(1): 93–100. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2006.05.057
11. Simon L., Castillo J., Oliva R. et al. Relationships between human sperm protamines, DNA damage and assisted reproduction outcomes. Biomed. Online. 2011; 23(6): 724–34. DOI: 10.1016/j.rbmo.2011.08.010
12. Bungum M., Humaidan P., Axmon A. et al. Sperm DNA integrity assessment in prediction of assisted reproduction technology outcome. Reprod. 2007; 22(1): 174–9. DOI: 10.1093/humrep/del326
13. Esbert M., Pacheco A., Vidal F. et al. Impact of sperm DNA fragmentation on the outcome of IVF with own or donated oocytes. Biomed. Online. 2011; 23(6): 704–10. DOI: 10.1016/j.rbmo.2011.07.010
14. Cho C.L., Agarwal A. Role of sperm DNA fragmentation in male factor infertility: a systematic review. Arab J. Urol. 2017; 16(1): 21–34. DOI: 10.1016/j.aju.2017.11.002
15. Simon L., Zini A., Dyachenko A. et al.A systematic review and meta-analysis to determine the effect of sperm DNA damage on in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection outcome. Asian J. Androl. 2017; 19(1): 80–90. DOI: 10.4103/1008-682X.182822
16. Zheng W.W., Song G., Wang Q.-L. et al. Sperm DNA damage has a negative effect on early embryonic development following in vitro fertilization. Asian J. Androl. 2018; 20(1): 75–9. DOI: 10.4103/aja.aja_19_17
17. Collins J.A., Barnhart K.T., Schlegel P.N. Do sperm DNA integrity tests predict pregnancy with in vitro fertilization? Steril. 2008; 89(4): 823–31. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2007.04.055
18. Sedó C.A., Bilinski M., Lorenzi D. et al. Effect of sperm DNA fragmentation on embryo development: clinical and biological aspects. JBRA Assist. Reprod. 2017; 21(4): 343–50. DOI: 10.5935/1518-0557.20170061
19. Casanovas A., Ribas-Maynou J., Lara-Cerrillo S. et al. Double-stranded sperm DNA damage is a cause of delay in embryo development and can impair implantation rates. Steril. 2019; 111(4): 699–707.e1. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2018.11.035
20. Мазилина М.А., Комарова Е.М., Лесик Е.А. и др. Влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на эффективность оплодотворения и развитие эмбрионов человека, культивируемых in vitro. Акушерства и гинекология. 2017; 3: 69–74.
21. Pabuccu E.G., Caglar G.S., Tangal S. et al. Testicular versus ejaculated spermatozoa in ICSI cycles of normozoospermic men with high sperm DNA fragmentation and previous ART failures. Andrologia. 2017; 49(2): e12609. DOI: 10.1111/and.12609
22. Tan J., Taskin O., Albert A. et al. Association between sperm DNA fragmentation and idiopathic recurrent pregnancy loss: a systematic review and meta-analysis. Biomed. Online. 2019; 38(6): 951–60. DOI: 10.1016/j.rbmo.2018.12.029
23. Venkatesh S., Singh A., Shamsi M.B. et al. Clinical significance of sperm DNA damage threshold value in the assessment of male infertility. Sci. 2011; 18(10): 1005–13. DOI: 10.1177/1933719111401662
24. Carlini T., Paoli D., Pelloni M. et al. Sperm DNA fragmentation in Italian couples with recurrent pregnancy loss. Biomed. Online. 2017; 34(1): 58–65. DOI: 10.1016/j.rbmo.2016.09.014
25. Kamkar N., Ramezanali F., Sabbaghian M. The relationship between sperm DNA fragmentation, free radicals and antioxidant capacity with idiopathic repeated pregnancy loss. Biol. 2018; 18(4): 330–5. DOI: 10.1016/j.repbio.2018.11.002
26. Ribas-Maynou J., Benet J. Single and double strand sperm DNA damage: different reproductive effects on male fertility. 2019; 10(2): 105. DOI: 10.3390/genes10020105
27. Ghorbani M., Vatannejad A., Khodadadi I. et al. Protective effects of glutathione supplem entation against oxidative stress during cryopreservation of human spermatozoa. Cryo Letters. 2016; 37(1): 34–40.
28. Симоненко Е.Ю., Гармаева С.Б., Яковенко С.А. и др. Влияние температуры хранения и условий криоконсервации на степень фрагментации ДНК сперматозоидов человека. Биофизика. 2016; 61(2): 316–20.
29. Osman A., Alsomait H., Seshadri S. et al. The effect of sperm DNA fragmentation on live birth rate after IVF or ICSI: a systematic review and meta-analysis. Biomed. Online. 2015; 30(2): 120–7. DOI: 10.1016/j.rbmo.2014.10.018
30. Palermo G.D., Neri Q.V., Cozzubbo T. et al. Perspectives on the assessment of human sperm chromatin integrity. Steril. 2014; 102(6): 1508–17. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2014.10.008
31. Shi X., Chan C.P.S., Waters T. et al. Lifestyle and demographic factors associated with human semen quality and sperm function. Biol. Reprod. Med. 2018; 64(5): 358–67. DOI: 10.1080/19396368.2018.1491074
32. Agarwal A., Gupta S., Du Plessis S. et al. Infertility abstinence time and its impact on basic and advanced semen parameters. 2016; 94: 102–10. DOI: 10.1016/j.urology.2016.03.059
33. Afsin M., Otludil B., Dede O. et al. An examination on composition of spermatozoa obtained from pre-operative and post-operative varicocele patients. Biol. 2018; 18(4): 361–7. DOI: 10.1016/j.repbio.2018.10.005
34. Sun X.-L., Wang J.-L., Peng Y.-P. et al. Bilateral is superior to unilateral varicocelectomy in infertile males with left clinical and right subclinical varicocele: a prospective randomized controlled study. Urol. Nephrol. 2018; 50(2): 205–210. DOI: 10.1007/s11255-017-1749-x
35. Zhang H., Xuan X., Yang S. et al. Selection of viable human spermatozoa with low levels of DNA fragmentation from an immotile population using density gradient centrifugation and magnetic-activated cell sorting. Andrologia. 2018; 50(1): DOI: 10.1111/and.12821
36. Nadalini M., Tarozzi N., Di Santo M. et al. Annexin V magnetic-activated cell sorting versus swim-up for the selection of human sperm in ART: is the new approach better then the traditional one? Assist. Reprod. Genet. 2014; 31(8): 1045–51. DOI: 10.1007/s10815-014-0267-3
37. Hammoud I., Boitrelle F., Ferfouri F. et al. Selection of normal spermatozoa with a vacuole-free head (x6300) improves selection of spermatozoa with intact DNA in patients with high sperm DNA fragmentation rates. Andrologia. 2013; 45(3): 163–70. DOI: 10.1111/j.1439-0272.2012.01328.x
38. Maettner R., Sterzik K., Isachenko V. et al. Quality of human spermatozoa: relationship between high-magnification sperm morphology and DNA integrity. Andrologia. 2014; 46(5): 547–55. DOI: 10.1111/and.12114
39. Bradley C.K., McArthur S.J., Gee A.J. et al. Intervention improves assisted conception intracytoplasmic sperm injection outcomes for patients with high levels of sperm DNA fragmentation: a retrospective analysis. 2016; 4(5): 903–10. DOI: 10.1111/andr.12215
40. Rashki Ghaleno L., Rezazadeh Valojerdi M., Chehrazi M. et al. Hyaluronic acid binding assay is highly sensitive to select human spermatozoa with good progressive motility, morphology, and nuclear maturity. Obstet. Invest. 2016; 81(3): 244–50. DOI: 10.1159/000439530
41. Oguz Y., Guler I., Erdem A. et al. The effect of swim-up and gradient sperm preparation techniques on deoxyribonucleic acid (DNA) fragmentation in subfertile patients. Assist. Reprod. Genet. 2018; 35(6): 1083–9. DOI: 10.1007/s10815-018-1163-z
42. Quinn M.M., Jalalian L., Ribeiro S. et al. Microfluidic sorting selects sperm for clinical use with reduced DNA damage compared to density gradient centrifugation with swim-up in split semen samples. Reprod. 2018; 33(8): 1388–93. DOI: 10.1093/humrep/dey239
43. Xue X., Wang W.-S., Shi J.-Z. et al. Efficacy of swim-up versus density gradient centrifugation in improving sperm deformity rate and DNA fragmentation index in semen samples from teratozoospermic patients. Assist. Reprod. Genet. 2014; 31(9): 1161–6. DOI: 10.1007/s10815-014-0287-z
44. Arafa M., AlMalki A., AlBadr M. et al. ICSI outcome in patients with high DNA fragmentation: testicular versus ejaculated spermatozoa. Andrologia. 2018; 50(1): DOI: 10.1111/and.12835
45. Greco E., Scarselli F., Iacobelli M. et al. Efficient treatment of infertility due to sperm DNA damage by ICSI with testicular spermatozoa. Reprod. 2005; 20(1): 226–30. DOI: 10.1093/humrep/deh590
46. Esteves S.C., Sánchez-Martín F., Sánchez-Martín P. et al. Comparison of reproductive outcome in oligozoospermic men with high sperm DNA fragmentation undergoing intracytoplasmic sperm injection with ejaculated and testicular sperm. Steril. 2015; 104(6): 1398–405. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2015.08.028
47. Negri L., Benaglia R., Monti E. et al. Effect of superoxide dismutase supplementation on sperm DNA fragmentation. Ital. di Urol. Androl. 89(3): 212–18. DOI: 10.4081/aiua.2017.3.212
48. Martínez-Soto J.C., Domingo J.C., Cordobilla B. et al. Dietary supplementation with docosahexaenoic acid (DHA) improves seminal antioxidant status and decreases sperm DNA fragmentation. Biol. Reprod. Med. 2016; 62(6): 387–95. DOI: 10.1080/19396368.2016.1246623
49. Stenqvist A., Oleszczuk K., Leijonhufvud I. et al. Impact of antioxidant treatment on DNA fragmentation index: a double-blind placebo-controlled randomized trial. Andrology. 2018; 6(6): 811–16. DOI: 10.1111/andr.12547